Expresión génica de cartílago articular conservado en diferentes condiciones y tratado con factores de crecimiento / Gene expression of joint cartilage preserved under different conditions and treated with growth factors

Objetivo. Analizar la expresión génica de factores anabólicos y catabólicos en cultivos de condrocitos obtenidos de cartílago, conservado a diferentes temperaturas, con distintos medios de conservación y tratados con diferentes factores de crecimiento. Material y método. Se cultivaron condrocitos de cartílago femoral distal de cordero joven conservado: a 4 ºC sin criopreservador; 4 ºC con PBS; 4 ºC con DMEM; -80 ºC sin criopreservador; -80 ºC con glicerol al 10%; y -80 ºC con DMSO al 10%. También se cultivó cartílago artrósico y viejo. Con las células cultivadas se efectuaron ensayos de RT-PCR con 10 ng de ARN por cada reacción y 20 nmoles de cada uno de los dos cebadores y fueron tratadas con diferentes factores de crecimiento (factor transformante de crecimiento β [TGF-β], factor de crecimiento fibroblástico [FGF-a], IGF-1, OP-1(R)). Las reacciones de RT-PCR fueron analizadas mediante electroforesis en geles de agarosa. Resultados. Los mejores resultados fueron en muestras cultivadas a 4 ºC con PBS; en el cartílago viejo disminuyó la expresión de todos los factores anabólicos, excepto el agrecano. El cartílago almacenado a -80 ºC con glicerol o DMSO expresó mayor cantidad de factores catabólicos. Al añadir los factores de crecimiento aumentó la expresión de TGF-β y se mantuvieron niveles de MMP-2 semejantes al grupo control. La mejor respuesta se obtuvo con OP-1(R), FGF-a e IGF-1. Conclusión. El cartílago almacenado a -80 ºC expresa mayor cantidad de factores catabólicos que el cartílago conservado a 4 ºC

Purpose. To analyze the gene expression of anabolic and catabolic factors in chondrocyte cultures obtained from cartilage preserved at different temperatures, using different preservation media and treated with growth factors. Material and methods. A culture was made of a young lamb's distal femoral cartilage preserved at 4 ºC without a cryopreservative agent, at 4 ºC with PBS, at 4 ºC with DMEM, at -80 ºC without a cryopreservative agent, at -80 ºC with 10% glycerol and -80 ºC with 10% DMSO. An additional culture was made of osteoarthritic and old cartilage. RT-PCR analyses were conducted of the cultured cells with 10 ng of RNA per reaction and 20 nmols of each of the two primers; the cells were also treated with growth factors (TGF-β, FGF-a, IGF-1, OP-1(R)). RT-PCR reactions were evaluated by means of electrophoresis in agarose gels. Results. The best results were obtained for samples cultured at 4 ºC with PBS; in old cartilage a reduction was observed in the expression of all anabolic factors, except agrecan. Cartilage stored at -80 ºC, with glycerol or DMSO, expressed a higher amount of catabolic factors. On adding growth factors, an increase was registered in the expression of TGF-β while MMP-2 levels remained unchanged, at the same level as those of the control group. The best response was obtained with OP-1(R), FGF-a and IGF-1. Conclusion. Cartilage stored at -80 ºC expresses a higher amount of catabolic factors than cartilage preserved at 4º (AU)

Análisis de la presencia de TGF-Beta1, BMP-7, MMP-2 y PEDF en distintas matrices óseas desmineralizadas / Analysis of TGF-Beta1, BMP-7, MMP-2 and PEDF presence in different demineralized bone matrices

Objetivo: Estudiar las proteínas de la matriz ósea desmineralizada, obtenidas de distintos donantes humanos y zonas óseas. Material y métodos: Se utilizaron matrices óseas desmineralizadas procedentes de hueso esponjoso granulado, cortical con esponjoso, cortical de tibia, cortical de fémur, cortical de peroné y de hueso esponjoso fragmentado. Se realizó un extracto de proteínas totales que fueron analizadas mediante western blot del factor de crecimiento transformante o TGF-Beta1, la proteína morfogénica ósea BMP-7, la metaloproteasa MMP-2 y el factor antiangiogénico PEDF (factor derivado del epitelio pigmentado). Resultados: Todas las matrices óseas resultaron positivas para la presencia de las 4 proteínas estudiadas, no obstante los niveles de éstas resultaron diferentes en las matrices empleadas. La matriz de hueso cortical presentó menor cantidad de TGF-Beta1, BMP-7 y PEDF. Conclusión: La presencia de proteínas inhibidoras (PEDF) o que favorecen la angiogénesis (MMP-2), apoya la hipótesis de la participación del proceso de formación de vasos en la osteoinducción por parte de este tipo de matrices. Así mismo, el tipo de matriz puede ser determinante en la inducción de la reparación de defectos óseos utilizando matrices óseas desmineralizadas

Aim: To study the osteoinduction capacity of different demineralized bone matrices obtained from different human bone fragments. Material and methods: Demineralized bone matrices obtained from trabecular granulated bone, trabecular and cortical bone, cortical bone from tibia, cortical bone from femur, cortical bone from fibula, and chips from trabecular bone, were used. We performed a total protein extract by digesting the matrix with collagenase, and used it in western blot experiments to analyze the presence of transforming growth factor TGF-Beta1, bone morphogenetic protein BMP-7, metaloproteinase MMP-2 and antiangiogenic factor PEDF or Pigment epithelium-derived factor. Results: All bone matrices were positive for the presence of the 4 proteins studied, nevertheless, the level of these proteins was different in the matrices employed. Conclusion: The presence of proteins that inhibit (PEDF) or facilitate (MMP-2) angiogenesis supports the participation of the process of new vessel formation in the osteoinduction exerted by these kind of matrices. In addition, the type of matrix may be a key factor in the repairing of bone defects using demineralized bone matrices